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HPLC科普专题:色谱法的分离原理

发表时间:2023-10-21 22:32:57 来源:乐鱼娱乐全站官网

  在我的上一篇文章里,大概地讲了一些色谱法的发展历史。在今天的这篇文章里,我将详细的展开阐述色谱法的分离原理。在我的学习生涯中,但凡涉及到原理的一些科目都相当地令人头痛。原理性质的科目或者课程正常的情况下都是在告诉你应然情景下的背后逻辑。

  对了,还没有阐述过为什么突然开始写HPLC这个冷门冷到爆,知道的人都不够绕乒乓球一圈的应用技术。事情的起因大概是这样的...在一个星期以前,老板突然让我做一个HPLC设备设施的使用情况调研。

  于是,认真的我开始在网上到处分发问卷。在分发问卷的同时,我想,调研做都做了,干脆写几篇文章普及一下这个有趣的小技术好了,也算复习一下当年学习过的知识。然后我就开始写了...

  色谱法的分离原理本理:溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时,由于与固定相(staionary phase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同,在固定相中的滞留时间不同,从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。

  所以顾名思义,流动的一相即为流动相,固定不同的一相即为固定相。固定相的选择对样品的分离起着及其重要的作用,有时甚至是决定性的作用!

  液相色谱法在最初的发展阶段是用直径很大的玻璃管柱,在室温和常压下,用液位差(用液位差计测量)输送流动相,称为经典液相色谱法。

  但是这种方法柱效低,分离分析时间长(常常需要几个小时才能完成)。因此在经典液相色谱法的基础上,高效液相色谱法(High performance Liquid Chormatography,HPLC)就快速地发展起来了。

  小颗粒具有高柱效的优点,但同时会引起高阻力。此时为完成分离动作,需要用高压帮助流动相的输送。所以高效液相色谱法也可以叫作高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chormatography,HPLC)。还可以叫高速液相色谱法(High Speed Liquid Chormatography,HSLP),因为这种方法分析速度很快。

  HPLC按分离机制的不同可大致分为液-固吸附色谱法、液-液分配色谱法(正相与反向)、离子交换色谱法、离子对色谱法和分子排阻色谱法共5种分离方法。

  液-固色谱法就是使用固体吸附剂进行分离。被分离的组分在色谱柱上的分离原型是根据固定相对组分吸附力的大小不同进行分离。

  这种分离方法适用于分离分子量200-1000的组分,大多时候用于分离非离子型化合物。用这种分离方法分离离子型化合物易产生拖尾。

  液-液色谱法的分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同,使得被分离组分分离。这个分离过程是一个分配平衡过程。

  这种分离的操作方法是使用特定的液态物质涂在担体表面,或者用化学键合于担体表面,形成固定相。

  现在行业内多采用的是化学键合固定相,比如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

  液液色谱法按固定相和流动相的机型不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法 (RPC)。其中正相色谱法常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)。而反相色谱法 (RPC)在现代液相色谱中应用最为广泛,据统计,它占整个HPLC应用占80%左右。

  随着柱填料的加快速度进行发展,反相色谱法的应用场景范围逐渐扩大,现在已经应用于某些无极样品或易解离样品的分析过程中。

  离子交换色谱常用缓冲液作为流动相。被分离组分在离子交换柱中的 保留时间 除了跟 组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外,它还受流动相的pH值和离子 强度 影响。

  pH值可改变化合物的解离程度,进而影响其与固定相的作用。事实上,流动相的盐浓度大,则离子强度高,不但不利于样品的解离,甚至还会导致样品以更快的速度流出,没办法实现分离效果。

  它是当被测组分离子,在与离子对试剂的离子形成中性的离子化合物后,非极性固定相中溶解度增大 ,实现其分离效果改善。

  离子对色谱法常用的色谱柱为ODS柱(即C18)。流动相为甲醇-水或乙腈-水两种组合溶液。

  排阻色谱法利用分子筛对分子大小量不同,根据各组分排阻能力的差异,完成被分离组分分离。

  这种分离方法的原理是小分子量的化合物能进入孔中,滞留时间长;而大分子量的化合物不能进入孔中,直接随流动相流出。

  排阻色谱法常用于分离高分子化合物,如组织提取物、多肽、蛋白质和、核酸等。

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